蛋白測(cè)定提純定氮儀操作步驟 概述

蛋白質(zhì)的測(cè)定方法，目前仍以1883年凱達(dá)爾氏(Kiedahl)發(fā)明的定氮法為基礎(chǔ)，它根據(jù)各種蛋白質(zhì)都具有固定比數(shù)的氮這一事實(shí)，通過對(duì)氮的測(cè)定而推算出蛋白質(zhì)含量，此法所得的含氮量除了確定屬于蛋白質(zhì)組成成分的氮以外，還包括非蛋白質(zhì)組成的其他有機(jī)及無機(jī)態(tài)氮，所以換算所得的蛋白質(zhì)含量稱作為粗蛋白含量，一般蛋白質(zhì)中的含量為18%，換算后即每6.25克蛋白質(zhì)中含有1克氮，因此6.25成為換算系數(shù)K，但是不同的農(nóng)產(chǎn)品及其制品的實(shí)際含氮量有區(qū)別，所以不同農(nóng)產(chǎn)品必須采用不同的換算系數(shù)，如花生、大豆、蠶豆、大麥、小麥、燕麥、黑麥等含氮為17.6%，求得K=5.7，蕎麥、葵花籽、亞麻籽、籽、棉花籽、蓖麻籽等換算系數(shù)則為K=5.50，玉米、菜籽為6.00，水稻為5.95，上述以外的其他農(nóng)產(chǎn)品的換算系數(shù)均適用6.25。盡管如此，目前世界上還沒有直接分離測(cè)定含蛋白質(zhì)的可行方法。因此，迄今為止在國(guó)內(nèi)外凱氏定氮法仍然是測(cè)定蛋白質(zhì)含量的經(jīng)典方法。所得結(jié)果準(zhǔn)確、穩(wěn)定。

我公司研制生產(chǎn)的KDN系列定氮儀（蛋白質(zhì)測(cè)定儀），是引進(jìn)消化吸收國(guó)內(nèi)外檢測(cè)新技術(shù)，結(jié)合我國(guó)國(guó)情，應(yīng)用凱氏定氮法原理，采用化學(xué)與物理學(xué)相結(jié)合完成的成套蛋白質(zhì)含量快速測(cè)定裝置。為糧食、食品、飼料、農(nóng)業(yè)、商檢等檢測(cè)部門提供了理想的檢測(cè)設(shè)備。

二、 工作原理

KDN系列定氮儀檢測(cè)原理為：

整套裝置，由電加熱消化器、蒸餾器兩部分組成。要提高蛋白質(zhì)含量測(cè)定的檢測(cè)速度，其關(guān)鍵是要加速樣品消化煮解的時(shí)間（40分鐘左右），KDN系列定氮儀消化裝置采用井式電加熱爐，增大了消化管受熱面，使消化管連同管內(nèi)所注入的10ml H2SO4及試樣置入消化管插入井式爐內(nèi)加熱取得更佳的熱效應(yīng)，在消化前置入硒片作為催化劑進(jìn)一步加速消化煮解，大大縮短消化時(shí)間。消化管內(nèi)溢出的SO2等有害氣體，通過消化管上的排污管經(jīng)抽吸泵由水帶入下水道，有效的抑制有害氣體的外逸，由省略了實(shí)驗(yàn)室中安裝毒氣通風(fēng)櫥，試樣經(jīng)40分鐘左右消化煮解，即可*消化。

消化的過程主要反應(yīng)如下：

R•C•H•NH2•COOH （蛋白質(zhì)）+ H2SO4 → CO2 + SO2 + NH3 + H2O

2NH3 + H2SO4 → (NH4)2SO4

蒸餾與吸收過程的主要反應(yīng)如下：

(NH4)2SO4 + 2NaOH → Na2SO4 + 2NH3 + 2H2O

NH3 + 4H3BO3 → NH4HB3O7 + 5H2O

然后經(jīng)滴定，計(jì)算蛋白質(zhì)含量，滴定的過程是鹽酸和硼酸氫銨反映的過程。

NH4HB3O7 + HCl + 5H2O → NH4Cl + 4 H3BO3

三、 技術(shù)參數(shù)

1． 測(cè)定品種：糧食、食品、飼料、釀造、土壤、制糖、乳制品、藥物等物質(zhì)

2． 測(cè)定范圍：含氮量0.05%~90% ( 0.1~200mg)

3． 測(cè)定數(shù)量：消化：一次同時(shí)消化個(gè)數(shù)按爐孔數(shù)定；單個(gè)蒸餾

4． 測(cè)定時(shí)間：消化每批45min；蒸餾每個(gè)6min

5． 測(cè)定重現(xiàn)性：平行試驗(yàn)結(jié)果符合GB/T 6423-94

6． 電源：220V，50Hz

四、 使用說明

1． 其他儀器和用具

1．1分析天平：感量0.0001g

1．2實(shí)驗(yàn)室用粉碎機(jī)或研缽

1．3酸式滴定管：25ml或10ml

1．4錐形瓶：容積250ml

1．5分樣篩：孔徑0.45mm(40目)

2．試劑

2．1鹽酸(HCl)：分析純(GB622) 0.05mol/L標(biāo)準(zhǔn)液，(4.2ml鹽酸，注入1000ml蒸餾水)碳酸鈉法標(biāo)定鹽酸。

2．2氫氧化鈉(NaOH)：化學(xué)純或工業(yè)純(GB629)、40g溶于蒸餾水中溶成100ml，配成40%水溶液(m/v)。

2．3硼酸(H3BO3)：分析純(GB628)2g，溶于蒸餾水中配成100ml 2%水溶液(m/v).

2．4混合指示劑：甲基紅(G5H15N3O2)(HG3-958)溶于乙醇配成0.1%乙醇溶液，溴甲酚綠(HG3-1220)溶于乙醇配成0.5%乙醇溶液，二種溶液等體積混合，陰涼處保存(保存期三個(gè)月以內(nèi))。

2．5硫酸銅(CuSO4•5H2O)分析純(GB655)10g；硫酸鉀(K2SO4) (HG3-920)分析純150g，在研缽中研磨，仔細(xì)混勻后過40目篩(加速劑)。（催化劑可以代替有毒的硒）

2．6濃硫酸(H2SO4)化學(xué)純(GB625)(含量98%、無氮)。

3．操作方法

3．1樣品消化

稱取經(jīng)粉碎通過40-60目/寸試樣0.5-1g(視含量而定)無損的置入已洗滌烘干的試管中加催化劑一片和10ml硫酸。

將消化管分別放入消化架各個(gè)孔內(nèi)，然后置于消化爐上，開啟抽吸泵水閥，使抽吸泵處于吸氣狀態(tài)。接通電源，再加熱初始階段需注意觀測(cè)，防止試樣因急沸而飛濺。(初化時(shí)，電壓調(diào)至150V左右溫度不宜太高。)

3．2蒸餾

KDN系列蒸餾器蒸餾時(shí)，堿液及蒸餾水采用電磁泵加液置入方法，因而避免了活塞中漏液現(xiàn)象，NaOH、H2O注入接口，橡膠管套入后分別置入NaOH、H2O盛器桶內(nèi)，加液時(shí)按面板上相應(yīng)開關(guān)，液體經(jīng)電磁泵自動(dòng)流入消化管內(nèi)注入毫升數(shù)視標(biāo)尺所注位置而定。

1．蒸餾器預(yù)熱：打開自來水，夾緊排水管、蒸汽開關(guān)，同時(shí)打開黃色進(jìn)水開關(guān)待電流打開表指針指示在2A-3A時(shí)馬上關(guān)閉黃色進(jìn)水開關(guān)，待蒸汽管噴出氣后打開黃色進(jìn)水開關(guān)，半分鐘后電流表穩(wěn)定在3.5-時(shí)關(guān)閉蒸汽開關(guān)，這一步只在剛開機(jī)時(shí)預(yù)熱。

2．在250ml三角接收瓶中加入50ml 2%H3BO3和2-3滴混合指示劑，并使接收瓶托盤往上移動(dòng)。

3．扳動(dòng)蒸餾托盤架把消化管固定在蒸餾器托盤上，然后按面板上H2¬O、NaOH開關(guān)，分別向消化管內(nèi)注入蒸餾水和氫氧化鈉溶液，然后開啟蒸汽開關(guān)，向試管內(nèi)注入蒸汽，進(jìn)行蒸餾，在接收液在150ml左右時(shí)移下接收瓶，用蒸餾水沖洗出氣口繼續(xù)蒸餾半分鐘，然后取下接收瓶，待滴定用。其他消化好樣品可重復(fù)這一步進(jìn)行蒸餾即可，不再需要預(yù)熱。

3．3滴定

用標(biāo)定后的鹽酸溶液進(jìn)行滴定接收瓶?jī)?nèi)的溶液，滴定溶液由綠色變?yōu)榈仙珵榻K點(diǎn)，記下消耗鹽酸溶液的毫升數(shù)，按下式計(jì)算蛋白含量：

蛋白含量(%)=式中：V2—滴定試樣時(shí)消耗酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積 (ml)

      V1—滴定空白時(shí)消耗酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積 (ml)

      C—標(biāo)準(zhǔn)酸溶液的摩爾濃度

      0.014—氮的毫克當(dāng)量數(shù)

      K—氮換算成粗蛋白質(zhì)的系數(shù)

      W—試樣重量 (g)

(空白測(cè)定：用0.1克糖代替樣品或不加樣品做空白測(cè)定)

平行測(cè)定的結(jié)果用算術(shù)平均值表示，保留小數(shù)后二位。

3．4 換算系數(shù)

結(jié)果報(bào)告中必須注明氮換算成粗蛋白質(zhì)的系數(shù)，換算系數(shù)見下表。

樣品名稱 換算系數(shù) 數(shù)據(jù)來源

小麥 5.70 GB2905

大麥 5.70 GB2905

釀酒大麥 6.25 TOCT10846

面粉 5.70 GB5009.5

面包 5.70 AOAC14.103

大豆 6.25 GB2905

5.71 GB5009.5

玉米 6.25 食品常用數(shù)據(jù)手冊(cè)

6.24 GB5009.5

飼料 6.25 GB6432

肉制品 6.25 GB5009.5

乳制品 6.38 GB5009.5

牛奶 6.38 ACAC16.036

芝麻 5.30 GB5009.5

油菜 5.53 油菜籽綜合利用

3．5注意事項(xiàng)

1．消化時(shí)若有氣體外溢，加大抽吸泵水的流速。

2．NaOH溶液因長(zhǎng)期不用，管內(nèi)容易產(chǎn)生粘固現(xiàn)象，每天工作完畢把NaOH外接皮管，一如蒸餾水瓶?jī)?nèi)，抽洗幾次，待下一次使用時(shí)，在蒸餾時(shí)需排出100mlNaOH，以防稀釋NaOH。

3．每次試樣蒸餾結(jié)束，必須迅速取下消化管，防止消化管液體倒吸至蒸發(fā)爐內(nèi)腐蝕電極板。

4．用戶在遵守本儀器的運(yùn)輸、貯存、安裝、調(diào)整和使用規(guī)程的條件下，如發(fā)現(xiàn)儀器因制造質(zhì)量問題而不能正常工作時(shí)，從收獲之日起一年內(nèi)實(shí)行三包；或開箱時(shí)發(fā)現(xiàn)包裝不良而發(fā)生損壞，附件與裝箱單不符，短缺零件等情況，請(qǐng)與我公司質(zhì)檢部門。來函注明產(chǎn)品型號(hào)、編號(hào)和出廠日期。本儀器使用時(shí)，要求用戶嚴(yán)格按照說明誰規(guī)定進(jìn)行，如有疑問或?qū)Y(jié)構(gòu)改進(jìn)的意見，請(qǐng)來函告知我公司質(zhì)檢部門。